ISSN 2953-6367  
http://revistainvestigo.com  
Octubre 2026  
Vol. 7 No. 21, PP. 436-465  
https://doi.org/10.56519/aewee134  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA  
IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
IMPORTANCE OF CHRISTMAS TREE STAINING IN SPERM  
IDENTIFICATION: A SYSTEMATIC REVIEW OF THE LITERATURE  
Madelyn Liset Martínez Cevallos1, Verónica Paulina Cáceres Manzano2  
{madelynl.martinez@unach.edu.ec1, vcaceres@unach.edu.ec2}  
Fecha de recepción: 02/10/2026  
/ Fecha de aceptación: 08/10/2026  
/ Fecha de publicación: 14/10/2026  
RESUMEN: La identificación microscópica de espermatozoides es un tipo de análisis aplicado  
a evidencias asociadas con agresiones sexuales, especialmente cuando las muestras contienen  
mezclas celulares, poca carga espermática o signos de degradación. Entre los métodos  
disponibles, la tinción Kernechtrot–picroindigocarmine (KPIC), también conocida como  
Christmas Tree, facilita la distinción morfológica de la cabeza y la cola del espermatozoide  
mediante una coloración contrastante. Esta revisión tuvo como objetivo evaluar y sintetizar la  
evidencia científica existente sobre la utilidad analítica y operativa de la tinción KPIC para la  
detección microscópica de espermatozoides. Se llevó a cabo una revisión sistemática siguiendo  
el protocolo PRISMA 2020 y al marco PICOS. Se consultó las bases de datos Scopus, PubMed,  
Web of Science y Google Scholar, sin restricción de año o idioma. Se recuperó 95 registros  
iniciales, se eliminó 38 duplicados, se examinó 57 publicaciones y se incluyeron 13 estudios  
después de la evaluación a texto completo. Los resultados indicaron que KPIC es eficaz para  
reconocer espermatozoides, ya sean escasos, diluidos, fragmentados, presentes en fondos  
celulares complejos. No obstante, la heterogeneidad metodológica impidió estimar métricas  
combinadas de sensibilidad, especificidad y exactitud. La cantidad y calidad de las células  
observables se vieron afectadas por factores como el tiempo, el tipo de sustrato, la eficiencia  
de recuperación y la presencia de contaminantes. En comparación con otros métodos, KPIC  
mostró ventajas de costo, accesibilidad, contraste morfológico y compatibilidad con análisis  
genéticos posteriores, mientras que su dependencia del observador y la menor automatización  
fueron limitaciones. En conclusión, KPIC sigue siendo útil para identificar células espermáticas,  
pero debe complementarse con marcadores seminales, medidas de control de calidad y análisis  
genéticos para fundamentar una interpretación forense contextualizada.  
1Posgradista Universidad Nacional Chimborazo (UNACH), maestría en criminalística y ciencias forenses, , https://orcid.org/0009-  
0001-1635-4562  
2Universidad Nacional Chimborazo (UNACH), https://orcid.org/0000-0001-5710-5661  
436  
Revista Científica Multidisciplinaria InvestiGo  
Riobamba – Ecuador  
Cel: +593 97 911 9620  
revisinvestigo@gmail.com  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
Palabras clave: Agresión sexual; espermatozoides; identificación forense; Kernechtrot-  
picroindigocarmín; semen; árbol de navidad tinción  
ABSTRACT: Microscopic sperm identification is a type of analysis applied to evidence  
associated with sexual assault, especially when samples contain cell mixtures, low sperm load,  
or signs of degradation. Among the available methods, Kernechtrot–picroindigocarmine (KPIC)  
staining, also known as Christmas Tree, facilitates the morphological distinction of the sperm  
head and tail by contrasting coloration. This review aimed to evaluate and synthesize the  
existing scientific evidence on the analytical and operational utility of KPIC staining for  
microscopic sperm detection. A systematic review was conducted following the PRISMA 2020  
protocol and the PICOS framework. Scopus, PubMed, Web of Science, and Google Scholar  
databases were consulted, with no year or language restriction. 95 initial records were  
retrieved, 38 duplicates were removed, 57 publications were examined, and 13 studies were  
included after full-text evaluation. The results indicated that KPIC is effective in recognizing  
sperm, whether scarce, diluted, fragmented, present in complex cell backgrounds. However,  
methodological heterogeneity prevented estimating combined metrics of sensitivity,  
specificity, and accuracy. The quantity and quality of observable cells were affected by factors  
such as time, substrate type, recovery efficiency, and the presence of contaminants. Compared  
to other methods, KPIC showed advantages in cost, accessibility, morphological contrast, and  
compatibility with subsequent genetic analyses, while its observer dependence and reduced  
automation were limitations. In conclusion, KPIC is still useful for identifying sperm cells, but it  
should be complemented with seminal markers, quality control measures, and genetic analyses  
to support contextualized forensic interpretation.  
Keywords: Sexual Assault; sperm; forensic identification; Kernechtrot picroindigocarmine;  
semen; christmas tree stain  
INTRODUCCIÓN  
La biología forense es un campo interdisciplinario que utiliza conocimientos celulares,  
bioquímicos y moleculares en el análisis de pruebas biológicas vinculados con hechos  
investigativos. A partir de esta información se puede establecer la naturaleza y el tejido  
procedente de una evidencia. Así que, se debe elegir el método analítico más adecuado para  
asegurar unos resultados fiables (1,2). Mientras que el análisis de ADN puede vincular una  
muestra con un individuo, determinar su naturaleza biológica posibilita establecer si el material  
analizado es compatible con sangre, saliva, semen u otro tejido (3,4). Este dato es  
particularmente relevante en la investigación de delitos sexuales, donde las muestras suelen  
contener mezclas de células del presunto agresor y de la víctima (5).  
La detección de semen o espermatozoides contribuye a corroborar la existencia de contacto  
sexual, seleccionar las muestras con mayor potencial probatorio y definir la estrategia de  
separación celular y análisis genético más apropiada (6,7). El semen es una matriz biológica  
heterogénea  
integrada  
por  
una  
fracción  
celular,  
constituida  
principalmente  
por  
437  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
espermatozoides y otras células presentes en el tracto reproductor, y una fracción acelular o  
plasma seminal, que contiene proteínas, enzimas y otros componentes secretados por las  
glándulas sexuales accesorias. Esta distinción es analíticamente relevante, dado que las pruebas  
forenses pueden dirigirse a componentes diferentes: la microscopía busca espermatozoides,  
mientras que los ensayos bioquímicos, inmunológicos o moleculares detectan sustancias del  
plasma seminal o marcadores cuya expresión se asocia con células espermáticas o tejido  
prostático (6,8).  
Las muestras procedentes de delitos sexuales rara vez presentan condiciones ideales  
(recolectada oportunamente, procedimiento adecuado, cantidad suficiente, sustrato de fácil  
recuperación), pues pueden contener pocos espermatozoides, abundantes células epiteliales,  
microorganismos, lubricantes, sangre menstrual, residuos del soporte y otros materiales  
capaces de interferir en su examen (5,9). A ello se suman la dilución, el lavado, la degradación,  
el tiempo transcurrido desde la deposición y las variaciones biológicas del donante, como  
oligospermia, azoospermia, infertilidad o vasectomía. Se ha demostrado que la condición de  
infertilidad puede interferir en el funcionamiento de los paneles de ARN mensajero dirigidos a  
los marcadores seminales o espermáticos, por lo que ningún marcador aislado representa de  
forma uniforme todas las condiciones biológicas del semen (8).  
La evaluación forense del semen normalmente se lleva a cabo como un proceso secuencial y  
complementario que incluye la exposición de posibles manchas, la aplicación de pruebas de  
orientación, la identificación de componentes seminales o espermatozoides y, por último, el  
análisis genético. Las fuentes de luz, como UV-A y bandas visibles violeta, azul o azul-verde,  
pueden facilitar la localización inicial de áreas sospechosas, aunque la fluorescencia no es  
exclusiva del semen y depende del sustrato, de la antigüedad y de las condiciones de la muestra  
(10). La prueba de fosfatasa ácida se utiliza como ensayo presuntivo porque esta enzima se  
encuentra en concentraciones elevadas en el plasma seminal, sin embargo, también puede estar  
presente en otros materiales biológicos y su actividad puede disminuir por degradación, lavado  
o exposición química, por lo que un resultado positivo requiere evaluación posterior y uno  
negativo no excluye semen (11,12).  
Los ensayos inmunocromatográficos y la tinción Christmas Tree responden a preguntas  
analíticas diferentes dentro del examen forense. En el esquema operativo del Servicio Nacional  
de Medicina Legal y Ciencias Forenses, la detección de P30 o antígeno prostático específico se  
emplea para determinar cualitativamente la presencia de líquido seminal, incluso en muestras  
procedentes de individuos azoospérmicos o vasectomizados; se considera positivo un resultado  
con concentraciones superiores a 4 ng/mL. No obstante, un resultado negativo puede deberse  
a una concentración inferior al umbral de detección o al efecto prozona ocasionado por  
concentraciones elevadas de P30, mientras que la orina masculina, especialmente la obtenida  
después de la eyaculación, puede producir resultados positivos (3,6).  
En contraste, la tinción Christmas Tree es un método para demostrar la presencia de  
espermatozoides a través de la identificación de sus particularidades morfológicas: núcleo rojo  
438  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
intenso, acrosoma rosado pálido y cola verde. No obstante, el procesamiento y la degradación  
de las muestras pueden ocasionar morfologías atípicas o la pérdida de la cola, por lo que su  
interpretación debe ser realizada por personal calificado y experimentado. Así, un resultado  
positivo para P30 junto con microscopía negativa no siempre constituye una discordancia, sino  
que puede reflejar la presencia de plasma seminal sin espermatozoides detectables. La  
interpretación forense, primero, debe reunir las observaciones de ambos ensayos junto con las  
características y las condiciones de la muestra antes de que se lleve a cabo un análisis genético  
que ofrezca evidencia de los posibles orígenes de dicho material biológico (4,13).  
Se destaca la tinción de Kernechtrot–picroindigocarmine, conocida también como KPIC o tinción  
Christmas Tree, entre los métodos citológicos empleados para facilitar la visualización de  
espermatozoides. Este procedimiento se realiza a través del uso de Nuclear Fast Red, que  
también se le llama Kernechtrot y picroindigocarmine: el primer reactivo tiñe de rojo el material  
nuclear, mientras que el segundo genera tonalidades verdes o azul-verdosas en el citoplasma,  
las membranas celulares y la cola espermática (14). La identificación no depende únicamente  
del color, sino de la valoración conjunta del tamaño, la forma ovalada y aplanada de la cabeza,  
la diferenciación acrosómica, el punto de inserción del cuello y la presencia eventual de la pieza  
intermedia y la cola (7,15).  
La principal utilidad forense de KPIC reside en que permite observar directamente estructuras  
celulares compatibles con espermatozoides y estimar su abundancia antes de seleccionar  
procedimientos posteriores. Los primeros estudios de dilución demostraron que la tinción podía  
facilitar la detección de espermatozoides presentes en concentraciones reducidas cuando se  
realizaba una búsqueda microscópica sistemática, mientras que su comparación con  
hematoxilina-eosina y fucsina alcalina mostró un mejor desempeño relativo durante las  
primeras 72 horas posteriores al contacto sexual (14,15). En los flujos analíticos actuales, el  
número de espermatozoides observados puede orientar la decisión entre extracción diferencial,  
procesamiento conjunto de la muestra o priorización de marcadores del cromosoma Y, con el  
propósito de reducir la pérdida de ADN masculino y mejorar la resolución de mezclas (7,16).  
La microscopía también ha conservado utilidad en materiales sometidos a condiciones adversas.  
Se han observado espermatozoides después del lavado repetido de tejidos y tras la desinfección  
con ozono, incluso cuando algunas pruebas presuntivas o inmunológicas redujeron su respuesta  
(11,12). Asimismo, se ha recuperado ADN de portaobjetos históricos previamente teñidos, lo  
que muestra que estos preparados pueden mantener valor probatorio en investigaciones  
retrospectivas (17). Sin embargo, un resultado microscópico positivo identifica material  
espermático, no individualiza al donante, en sentido inverso, un resultado negativo no descarta  
plasma seminal ni la posible recuperación de ADN masculino (13).  
El desempeño de la tinción está condicionado por variables biológicas, ambientales y operativas.  
La probabilidad de encontrar espermatozoides disminuye cuando existe una concentración  
celular baja, ha transcurrido un periodo prolongado desde el contacto o las células han sufrido  
degradación y separación de la cabeza y la cola. Además, la presencia abundante de células  
439  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
epiteliales, bacterias, levaduras, detritos y precipitados de tinción puede dificultar la  
discriminación visual (9,15). La coloración tampoco es específica de especie: los  
espermatozoides caninos, por ejemplo, pueden captar KPIC y mostrar un patrón parcialmente  
semejante al humano, aunque existan diferencias morfológicas y cromáticas que permitan su  
diferenciación por un examinador competente (18).  
El soporte y las condiciones posteriores a la deposición también modifican la recuperación, pues  
el tipo de tejido, la densidad de la trama, el detergente, la temperatura y el número de ciclos de  
lavado influyen en la retención de espermatozoides y pueden originar muestras  
microscópicamente positivas pese a resultados negativos de fosfatasa ácida o PSA (12,19). A  
estas limitaciones se añaden el tiempo requerido para examinar todo el portaobjetos, la fatiga  
visual y la variabilidad asociada con la experiencia del observador, especialmente cuando existen  
entre uno y cinco espermatozoides en toda la preparación (7).  
La investigación reciente se ha orientado a complementar la tinción convencional mediante  
métodos más sensibles, objetivos y automatizables. En el campo de la microscopía, se han  
desarrollado plataformas capaces de escanear portaobjetos teñidos con Christmas Tree y  
clasificar imágenes mediante redes neuronales profundas, una validación reciente del sistema  
Metafer informó una sensibilidad de 0.99, una especificidad de 0.99 y una exactitud de 0.99  
dentro del conjunto evaluado, aunque todavía se observaron clasificaciones falsas positivas y  
falsas negativas que justifican la revisión experta (7). De manera similar, el sistema Spitz empleó  
un modelo YOLO entrenado con imágenes de casos forenses teñidas con KPIC e incorporó  
reconstrucción espacial y verificación humana de las células detectadas (20).  
Paralelamente, se investigan técnicas dirigidas a componentes del plasma seminal o a su  
expresión molecular, entre ellas la espectrometría de masas de péptidos de semenogelina, los  
paneles de ARN mensajero y microARN y los sistemas avanzados de separación celular  
(5,6,8,21). Estos enfoques buscan aumentar la especificidad, reducir el tiempo de análisis y  
preservar una mayor cantidad de material para la elaboración de perfiles genéticos.  
A pesar del uso continuo de la tinción KPIC en los protocolos de biología forense, la evidencia  
disponible sobre su rendimiento presenta limitaciones importantes. Son escasos los estudios  
recientes dedicados específicamente a validar KPIC y existe una marcada heterogeneidad en los  
tipos de muestras, procedimientos de tinción, criterios morfológicos, escalas de cuantificación  
y métodos de referencia empleados, lo que dificulta comparar resultados y establecer  
estimaciones consistentes de sensibilidad, especificidad y reproducibilidad (4,7). Aunque  
algunas investigaciones han examinado su comportamiento frente al lavado, la degradación o  
la exposición química, todavía no se conoce con suficiente precisión cómo interactúan el tiempo  
transcurrido, el método de recolección, el almacenamiento, el transporte, el sustrato y las  
condiciones ambientales en situaciones representativas de la práctica forense (11,12,19).  
Esta incertidumbre adquiere especial relevancia en laboratorios con recursos limitados, donde  
las condiciones logísticas, la disponibilidad de personal especializado y el acceso a tecnologías  
440  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
complementarias pueden ser diferentes de aquellos en los que se han llevado a cabo las  
principales verificaciones. También, son insuficientes las comparaciones integrales entre KPIC y  
pruebas inmunológicos, moleculares, fluorescentes o automatizados en términos de  
desempeño analítico, tiempo de procesamiento, costo, conservación de la muestra y posible  
análisis subsiguiente a ADN (5–7).  
El presente estudio tiene como objetivo general evaluar y sintetizar la evidencia científica  
disponible sobre la utilidad analítica y operativa de la tinción Kernechtrot–picroindigocarmine  
para la detección microscópica de espermatozoides en muestras relacionadas con  
investigaciones de agresiones sexuales..  
Para ello, se plantean las siguientes preguntas de investigación: (1) ¿Qué desempeño analítico  
ha demostrado la tinción KPIC en muestras forenses o experimentalmente representativas?; (2)  
¿Cómo influyen el tiempo transcurrido desde la deposición o recolección, el procedimiento de  
toma de muestra, el almacenamiento, el transporte, el tipo de sustrato y la exposición ambiental  
en sus resultados?; (3) ¿Qué ventajas y desventajas presenta frente a otras técnicas  
microscópicas, inmunológicas, moleculares, fluorescentes o automatizadas?  
MATERIALES Y MÉTODOS  
Se realizó una revisión sistemática de la literatura sobre la utilidad de la tinción KPIC siguiendo  
las recomendaciones de la declaración Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and  
Meta-Analyses (PRISMA 2020), con el propósito de asegurar la transparencia y reproducibilidad  
de los procesos de identificación, selección, evaluación y síntesis de la evidencia (22). La  
formulación de los criterios de elegibilidad y la organización de las preguntas de investigación  
se realizaron mediante el marco PICOS, cuyos criterios se presentan en la tabla 1.  
Tabla 1. Criterios PICOS.  
Ejes temáticos  
Criterios  
P: Población o muestra  
Muestras biológicas humanas analizadas en contexto forense o en condiciones  
experimentales representativas para la identificación de espermatozoides. Se  
admitieron también muestras seminales procedentes de estudios andrológicos  
sobre criptozoospermia, oligozoospermia severa  
o
diagnóstico inicial de  
azoospermia, cuando aportaron datos sobre la detección de espermatozoides  
escasos mediante la tinción Christmas Tree.  
I: Intervención o prueba  
índice  
Aplicación de la tinción Christmas Tree, Kernechtrot–picroindigocarmine, KPIC,  
Nuclear Fast Red/Picroindigocarmine o denominaciones equivalentes para la  
identificación microscópica de espermatozoides.  
C: Comparador  
O: Resultados  
Otras técnicas microscópicas utilizadas para detectar espermatozoides  
Desempeño de la tinción Christmas Tree en la identificación y diferenciación  
morfológica de espermatozoides, incluyendo su capacidad de detección en  
441  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
muestras con baja concentración espermática. Se consideraron los límites de  
detección cuando fueron expresamente cuantificados y, en los estudios  
andrológicos, la identificación de espermatozoides escasos mediante  
procedimientos de concentración de la muestra combinados con tinción.  
S: Diseños de estudio  
Estudios primarios que evalúen el desempeño, utilidad, reproducibilidad,  
aplicación o factores modificadores de KPIC.  
Criterios de elegibilidad  
Se incluyeron investigaciones primarias a la fecha de búsqueda (21/09/2026), las cuales  
evaluaron la aplicación de la tinción Christmas Tree o alguna de sus denominaciones  
equivalentes para la identificación de espermatozoides en muestras forenses humanas. Los  
estudios deben describir el procedimiento de tinción y comunicar al menos un resultado  
relacionado con su desempeño analítico, capacidad de detección, interpretación morfológica,  
reproducibilidad, condiciones preanalíticas, exposición ambiental, limitaciones técnicas o  
comparación con otra técnica microscópica. No se aplicó restricciones por año de publicación ni  
por idioma.  
Se excluyeron revisiones narrativas, sistemáticas, metaanálisis, editoriales, cartas, comentarios,  
protocolos, capítulos de libro o libros completos, resúmenes de congresos y documentos que  
no presenten resultados empíricos originales. También se descartaron los estudios que no  
evalúen la tinción KPIC desde una perspectiva forense o analítica, las investigaciones efectuadas  
únicamente con muestras animales y los estudios sobre otras tinciones o pruebas de semen que  
no incorporen KPIC. Así mismo, no se contaron las publicaciones que no tenían información  
suficiente para determinar las características de las muestras, el procedimiento aplicado o los  
resultados obtenidos, además de las publicaciones sin acceso al texto completo.  
Fuentes de información y estrategia de búsqueda  
La búsqueda bibliográfica se llevó a cabo en Scopus, PubMed, Web of Science y Google Scholar,  
bases de datos seleccionadas por su amplia cobertura de literatura biomédica, forense y  
multidisciplinaria. La estrategia se estructuró en base a dos categorías conceptuales relevantes:  
“Christmas Tree” y “sperm”. Los términos se combinaron mediante el operador booleano OR  
dentro de cada categoría y mediante AND entre ambas categorías.  
En Scopus, PubMed y Web of Science, la búsqueda se aplicó a los campos de título, resumen y  
palabras clave o a sus equivalentes. En Google Scholar, la revisión se limitó a los primeros 50  
resultados recuperados, que se incorporaron al proceso de cribado y evaluación de elegibilidad.  
Las estrategias que se utilizaron en las cuatro fuentes de información se detallan en la tabla 2.  
442  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
Tabla 2. Estrategias de búsqueda.  
Base de  
datos  
Cadena de búsqueda  
Nro. de  
estudios  
Scopus  
( TITLE-ABS-KEY ( "Christmas Tree" OR "Christmas Tree stain*" OR  
20  
"Christmas-tree  
stain*"  
OR  
"Kernechtrot-picroindigocarmine"  
OR  
"Kernechtrot picroindigocarmine" OR "KPIC*" OR "picroindigocarmine  
nuclear fast red" OR "PIC/NF" OR "PIC-NF" OR "PIC NF" OR "NF/PIC" OR "NF-  
PIC" OR "NF PIC" ) AND TITLE-ABS-KEY ( sperm* OR semen OR seminal OR  
"seminal fluid*" ) )  
PubMed  
("Christmas Tree"[Title/Abstract] OR "Christmas Tree stain*"[Title/Abstract]  
13  
OR  
"Christmas-tree  
stain*"[Title/Abstract]  
OR  
"Kernechtrot-  
"Kernechtrot  
picroindigocarmine"[Title/Abstract]  
picroindigocarmine"[Title/Abstract]  
"picroindigocarmine  
OR  
OR  
fast  
"KPIC*"[Title/Abstract]  
red"[Title/Abstract]  
OR  
OR  
nuclear  
OR  
"PIC/NF"[Title/Abstract]  
"PIC-NF"[Title/Abstract]  
OR  
"PIC  
NF"[Title/Abstract] OR "NF/PIC"[Title/Abstract] OR "NF-PIC"[Title/Abstract]  
OR  
"NF  
PIC"[Title/Abstract])  
AND  
(sperm*[Title/Abstract]  
OR  
semen[Title/Abstract]  
fluid*"[Title/Abstract])  
OR  
seminal[Title/Abstract]  
OR  
"seminal  
Web  
Science  
of  
(TS=("Christmas Tree" OR "Christmas Tree stain*" OR "Christmas-tree stain*"  
OR "Kernechtrot-picroindigocarmine" OR "Kernechtrot picroindigocarmine"  
OR "KPIC*" OR "picroindigocarmine nuclear fast red" OR "PIC/NF" OR "PIC-  
NF" OR "PIC NF" OR "NF/PIC" OR "NF-PIC" OR "NF PIC") AND TS=(sperm* OR  
semen OR seminal OR "seminal fluid*"))  
12  
Scholar  
("Christmas Tree" OR KPIC OR Kernechtrot) (sperm OR semen)  
Total  
50  
95  
Proceso de selección de estudios  
El desarrollo de la búsqueda y selección se realizó en fases consecutivas de acuerdo al flujo de  
PRISMA 2020. En la fase de identificación, se recogieron y exportaron todas las referencias  
recuperadas en las bases de datos seleccionadas. Posteriormente, se identificaron y eliminaron  
los registros duplicados. En el cribado, se revisó los títulos y resúmenes, aplicando los criterios  
de inclusión y exclusión. En la fase de elegibilidad, se evaluó de manera independiente el texto  
completo de las publicaciones, seleccionando aquellas que se consideren pertinentes. Las  
discrepancias se resolvieron con el consenso de las partes.  
Evaluación del riesgo de sesgo  
La calidad metodológica de los estudios se evalúo mediante herramientas estandarizadas  
seleccionadas de acuerdo con el diseño de cada investigación. Los estudios de precisión o  
443  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
exactitud diagnóstica fueron valorados mediante la herramienta QUADAS-2. Los estudios  
observacionales retrospectivos y observacionales analíticos se evaluaron con la Newcastle–  
Ottawa Scale (NOS). Para los estudios experimentales de laboratorio in vitro orientados al  
análisis de variables experimentales, se utilizó la herramienta JBI para estudios analíticos de  
laboratorio. Por último, los estudios experimentales metodológicos y comparativos de  
laboratorio enfocados en la evaluación de la exactitud diagnóstica fueron examinados mediante  
el JBI for Diagnostic Test Accuracy Studies. La selección de cada instrumento se realizó según el  
propósito, diseño y tipo de resultados reportados por cada estudio.  
Extracción y síntesis de la información  
La información fue extraída mediante una matriz estandarizada en Excel. Para cada uno de los  
estudios se registró autor, año de publicación, país, contexto (forense o experimental), diseño,  
tamaño y procedencia de la muestra, tipo de muestra biológica, composición, sustrato utilizado,  
tiempo transcurrido, procedimiento de toma de muestra, condiciones y duración del  
almacenamiento, transporte, exposición ambiental y otras condiciones de degradación,  
reactivos, fijación, protocolo de tinción, tiempos de procesamiento, criterios de positividad,  
controles positivos y negativos, resultados de desempeño, sensibilidad, especificidad, exactitud,  
límite de detección, concordancia y reproducibilidad, dificultades interpretativas, tiempo, costo,  
requerimientos técnicos, consumo de muestra, compatibilidad con pruebas genéticas  
posteriores, conclusiones y limitaciones.  
Como consecuencia de la variedad de los diseños, muestras, condiciones experimentales,  
comparadores y medidas de resultado, se llevó a cabo una síntesis narrativa y temática de los  
hallazgos. Inicialmente, las características y resultados de los estudios se organizaron a través  
de tablas descriptivas. Posteriormente, la evidencia se organizó en cuatro temas relacionados  
con las preguntas de investigación: desempeño analítico de KPIC; influencia de las condiciones  
preanalíticas y ambientales; limitaciones, fuentes de error y dificultades de interpretación; y  
ventajas y desventajas frente a otras técnicas microscópicas.  
RESULTADOS  
Selección de estudios  
La búsqueda bibliográfica permitió identificar 95 registros procedentes de cuatro fuentes de  
información: Scopus 20, PubMed 13, Web of Science 12 y Google Scholar 50. Después de  
eliminar 37 registros duplicados, se sometieron a cribado 58 publicaciones mediante la revisión  
de sus títulos, resúmenes y palabras clave. En esta fase se excluyeron 43 registros por no cumplir  
los criterios de elegibilidad, no aportar información pertinente sobre la tinción Christmas Tree  
o no contribuir a responder las preguntas de investigación. En consecuencia, se solicitaron para  
recuperación 14 publicaciones potencialmente relevantes, de las cuales 1 no pudo obtenerse a  
texto completo.  
444  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
Los 13 artículos recuperados fueron evaluados íntegramente para determinar su elegibilidad,  
constituyéndose en el corpus primario para la síntesis. El proceso de identificación, cribado,  
elegibilidad e inclusión de los estudios se presenta en el diagrama de flujo PRISMA 2020 (Figura  
1).  
Identificación de estudios a través de bases de datos y registros  
Registros identificados desde:  
Registros eliminados antes de la  
Bases de datos (n = 4)  
Scopus (n = 20)  
PubMed (n = 13)  
(n = 38)  
Web of Science (n = 12)  
Scholar (n = 50)  
evaluación:  
Registros duplicados eliminados  
Registros (n = 95)  
Registros excluidos:  
Registros que después de la revisión  
de títulos, resumen y palabras clave  
no contribuyen al estudio ni  
Registros examinados  
(n = 57)  
responden a las preguntas de  
investigación (n = 43)  
Estudios solicitados para  
Estudios no recuperados  
recuperación  
(n = 1)  
(n = 14)  
Estudios excluidos:  
Registros con alto riesgo de sesgo  
(n = 0)  
Estudios evaluados para  
elegibilidad  
(n = 13)  
Estudios incluidos en la revisión  
(n = 13)  
Figura 1. Diagrama de flujo PRISMA 2020  
Riesgo de sesgo  
La figura 2 presenta la síntesis de la evaluación del riesgo de sesgo de los 13 estudios incluidos,  
realizada mediante QUADAS-2, NOS y las herramientas de evaluación crítica del Joanna Briggs  
Institute (JBI), según el diseño de cada investigación.  
445  
Identificación  
Cribado  
Inclusión  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
446  
Figura 2. Síntesis de la evaluación del riesgo de sesgo  
Características de los estudios  
Las características generales de los estudios incluidos se presentan en la Tabla 3. Para cada  
investigación se presenta el autor y año de publicación, el país de procedencia, el contexto de  
aplicación, el diseño metodológico, el tamaño y origen de la muestra, el tipo de material  
biológico examinado y el sustrato utilizado.  
Tabla 3. Características de los estudios.  
Tamaño y  
Procedencia de la  
Muestra  
Diseño del  
Estudio  
Tipo de Muestra  
Biológica  
Sustrato  
Utilizado  
Autor(es)  
País  
Contexto  
Athira et  
al.( 23)  
India  
Forense /  
Experimental  
Experimental in  
vitro  
1 donante sano  
(consentimiento  
informado)  
Semen eyaculado  
con contaminantes  
Tela de  
algodón blanca  
Monteiro  
et al. (24)  
Brasil  
Andrológico /  
Clínico  
Observacional  
retrospectivo  
148 pacientes con  
azoospermia no  
obstructiva  
Semen eyaculado  
(sedimento)  
Portaobjetos  
de vidrio (área  
2-4 cm²)  
Allery et  
al. (15)  
Francia  
Forense /  
Clínico  
Experimental  
de precisión  
diagnóstica  
comparativa  
174 mujeres en  
centro de  
Muestras/hisopos  
cervicovaginales  
Hisopos /  
portaobjetos  
de vidrio  
infertilidad  
Panicker  
India  
Forense /  
Experimental in  
vitro  
1 donante  
Semen humano  
Algodón, Nylon  
y Denim (8x8  
cm)  
et al. (25)  
Experimental  
voluntario (48  
muestras de tela)  
depositado (200 µL)  
Simons &  
Vintiner  
(26)  
Nueva  
Zelanda  
Forense /  
Experimental  
Experimental in  
vitro  
1 donante femenina Células epiteliales  
Portaobjetos  
de vidrio y  
Poly-L-lisina  
(6 láminas por  
grupo)  
vaginales  
Fejes et al.  
(11)  
Hungría  
Forense /  
Experimental  
Experimental in  
vitro  
Donantes sanos  
Semen, sangre y  
saliva (puros y  
diluidos)  
Portaobjetos  
de vidrio y  
sábana algodón  
JBI Checklist para Estudios de Exactitud Diagnóstica  
JBI para Estudios Analíticos de Laboratorio  
Newcastle–Ottawa Scale (NOS).  
QUADAS-2  
2
2
2
2
1
4
4
0
1
2
3
5
6
7
Bajo riesgo  
Riesgo moderado  
Alto riesgo  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
447  
Hendin et  
al. (27)  
Estados  
Unidos  
Andrológico /  
Clínico  
Observacional  
analítico  
20 hombres con  
falla  
Semen eyaculado  
(falla  
Portaobjetos  
en  
espermatogénica;  
10 controles CBAVD  
espermatogénica)  
citocentrífuga  
Cytospin  
Sharma et  
al. (28)  
Estados  
Unidos  
Andrológico /  
Clínico  
Observacional  
retrospectivo  
de precisión  
diagnóstica  
251 hombres con  
azoospermia; 46 a  
mTESE  
Semen eyaculado  
(pellet  
Portaobjetos  
esmerilados  
Cytospin 4 (32  
mm²)  
resuspendido)  
Leubitz &  
Savage  
(14)  
Estados  
Unidos  
Forense /  
Experimental  
Experimental  
de dilución  
6 ejaculados  
frescos; 6  
oligospérmicos y 3  
azoospérmicos  
Semen humano  
fresco (<4 h)  
Portaobjetos  
(frotis directo e  
hisopo)  
Humanes  
et al. (20)  
Brasil  
Forense  
Estudio  
comparativo de  
precisión  
399 parches (IA); 30  
casos reales (3  
peritos)  
Extractos de  
hisopos/ropa de  
agresión sexual  
Portaobjetos  
de vidrio  
montados  
diagnóstica  
Mitchell  
(29)  
Estados  
Unidos  
Forense  
Experimental  
de validación  
Hisopos orales,  
vaginales, rectales,  
postcoitales y 10  
casos reales  
Semen puro/diluido  
y muestras  
Portaobjetos  
de vidrio  
animales  
(raspado en  
agua)  
Alger et al. Estados  
(30) Unidos  
Forense  
Experimental  
metodológico  
376 láminas de  
casos reales de  
agresión sexual  
Extractos de  
hisopos/cortes de  
tela reales  
Portaobjetos  
con anillo de  
enfoque blanco  
Grosjean  
& Castella  
(31)  
Suiza  
Forense  
Experimental  
comparativo  
Hisopos Copan  
FLOQSwabs  
(voluntarias y casos  
reales)  
Semen diluido  
(1:20-1:1000) y  
mezclas biológicas  
Hisopos Copan;  
láminas IFI vs  
SuperFrost  
Los hallazgos muestran estudios publicados entre 1984 y 2026 y procedentes de 7 países, con  
una mayor representación de Estados Unidos (n = 5), seguido de India y Brasil (n = 2 cada uno).  
Predominó las investigaciones desarrolladas en un contexto forense (n = 10), mientras que 3  
correspondieron al ámbito andrológico o clínico. Asimismo, 10 estudios emplearon diseños  
experimentales, comparativos o de validación y tres utilizaron diseños observacionales.  
Las muestras fueron heterogéneas, las cuales comprendieron desde experimentos con un único  
donante hasta evaluaciones de 251 pacientes, 376 láminas de casos reales y 399 parches de  
imagen. Aunque el portaobjetos de vidrio fue el soporte más utilizado, también se analizaron  
hisopos y diferentes tejidos. Los materiales biológicos incluyeron semen fresco, diluido,  
contaminado o procedente de pacientes con alteraciones espermatogénicas, muestras  
cervicovaginales, células epiteliales, mezclas con sangre y saliva, y evidencia recuperada de  
agresiones sexuales.  
La Tabla 4 sintetiza el desempeño analítico de la tinción KPIC, considerando las características  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
448  
de las muestras y las unidades de análisis, las condiciones de aplicación y los criterios de  
positividad, los estándares de referencia y controles, los resultados primarios, las medidas de  
sensibilidad, especificidad y exactitud, los límites empíricos de detección y la reproducibilidad.  
Debido a la heterogeneidad de los diseños y desenlaces, se diferenciaron las medidas formales  
de exactitud diagnóstica de las proporciones de detección, los incrementos respecto de otros  
procedimientos y los resultados de sistemas automatizados, evitando interpretar estos  
indicadores como métricas equivalentes.  
Tabla 4. Desempeño analítico de la tinción KPIC en las muestras evaluadas.  
Límite de  
detección y otros  
resultados  
Aplicación de  
KPIC y criterio de  
positividad  
Estándar de  
referencia y  
controles  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Autor(e  
s)  
Datos primarios de  
desempeño  
analíticos  
Athira et Secado al  
DAPI como  
comparador  
principal;  
luminiscencia UV y  
prueba de  
Florence. Control  
positivo: semen sin  
contaminantes.  
Controles  
negativos: tejidos  
tratados solo con  
KPIC permitió observar  
espermatozoides en  
todas las condiciones  
contaminadas  
evaluadas, aunque la  
densidad celular  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud: NR.  
Se observaron  
al. (23)  
aire/calor;  
células dispersas  
después de 30 días;  
no se determinó un  
límite de detección  
cuantitativo.  
Nuclear Fast Red  
durante 20 min y  
picroindigocarmin  
e durante 15 - 20  
s. Lectura a  
disminuyó con el  
1000×;  
tiempo. DAPI mantuvo  
una detección más  
constante en las  
Positivo: cabeza  
roja/rosa y cola  
verde.  
muestras con mayor  
agua o detergentes. contaminación.  
Monteir  
o et al.  
(24)  
Microcentrifugaci  
ón del sedimento;  
fijación con etanol 2010. No se  
Análisis seminal  
conforme a OMS  
KPIC después de la  
microcentrifugación  
detectó  
espermatozoides en  
21/148 muestras  
(14,2%) previamente  
clasificadas como  
azoospérmicas, que  
fueron reclasificadas  
como  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud: NE.  
Detección de un  
espermatozoide  
aislado en el  
durante 15 min;  
Nuclear Fast Red  
durante 15 min y  
picroindigocarmin  
e durante 15 s.  
Positivo: región  
postacrosómica  
roja, acrosoma  
rosa claro y cola  
verde-azulada.  
reportó controles  
sedimento  
positivos o  
negativos  
específicos.  
procesado.  
No se estableció  
una concentración  
mínima.  
criptozoospérmicas.  
Allery et  
al. (15)  
Secado al aire y  
fijación en  
alcohol-éter.  
Positivo:  
presencia de  
espermatozoides  
a 400×; recuento  
medio en 100  
campos.  
Comparación  
directa con  
hematoxilina-  
eosina y fucsina  
alcalina. Lectura  
ciega de las  
Detección: KPIC 61/174  
(35,1 %), H&E 60/174  
(34,7 %) y fucsina  
alcalina 49/174 (28,4  
%). Media de  
espermatozoides/camp  
o: 8,3 con KPIC, 4,6 con  
H&E (p = 0,023) y 4,2  
con fucsina (p = 0,017).  
Entre 12–72 h: 9,1  
espermatozoides/camp  
o con KPIC frente a 2,6  
con H&E.  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Ningún método  
detectó  
espermatozoides  
después de 72 h  
postcoito; este  
resultado  
diagnóstica: NR.  
láminas.  
corresponde a una  
ventana temporal  
observada, no a un  
límite analítico de  
concentración.  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
449  
Límite de  
detección y otros  
resultados  
Aplicación de  
KPIC y criterio de  
positividad  
Estándar de  
referencia y  
controles  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Autor(e  
s)  
Datos primarios de  
desempeño  
analíticos  
Panicker Fijación por calor;  
Fluorescencia  
La densidad  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Se mantuvo  
positividad  
et al.  
(25)  
rojo neutro  
mediante VSC-  
6000/HS y prueba  
de Barberio. Un  
control negativo y  
tres réplicas por  
tejido y tiempo.  
espermática disminuyó  
con la antigüedad de la  
mancha: algodón r =  
−0,94; nailon r = −0,77;  
mezclilla r = −0,77. La  
recuperación fue mayor  
en algodón.  
durante 15 min y  
picroindigocarmin  
e durante 15s.  
Lectura a 400x.  
Positivo:  
microscópica hasta  
7 días en los tres  
tejidos, con menor  
proporción de  
espermatozoides  
intactos.  
diagnóstica: NR.  
espermatozoides  
completos o  
cabezas y colas  
separadas; escala  
de densidad de +1  
a +4.  
Simons  
&
Vintiner  
(26)  
Fijación en  
H&E,  
KPIC y H&E produjeron  
la mayor recuperación  
de ADN por célula, sin  
diferencia  
estadísticamente  
significativa entre  
ambas (ANOVA: F =  
1,79; p = 0,186).  
Sensibilidad,  
Límite de detección  
de KPIC: NE. Para el  
análisis genético  
posterior se  
utilizaron  
aproximadamente  
1,5 ng con  
acetona durante  
90 s; Nuclear Fast  
Red durante 15  
min y  
picroindigocarmin  
e durante 15 s.  
El desenlace fue  
recuperación de  
ADN y obtención  
de perfiles STR, no  
identificación  
espermática.  
inmunohistoquímic  
a DAB, tinción de  
Danes modificada y  
láminas no teñidas.  
Control interno de  
amplificación  
especificidad y  
exactitud para  
identificación  
espermática: NA.  
mediante  
Quantifiler.  
Identifiler y 0,1 ng  
con SGM Plus.  
KPIC permitió obtener  
perfiles STR completos  
o altamente  
informativos después  
de 10 semanas.  
Fejes et  
al. (11)  
Secado al aire y  
tinción según  
Hendin et al.;  
lectura  
morfológica a  
100–400×.  
H&E, prueba de  
fosfatasa ácida,  
inmunoensayo de  
PSA, RT-qPCR y  
perfiles STR.  
Controles pareados  
no tratados con  
ozono.  
La exposición a ozono  
no produjo cambios  
visibles en la morfología en todas las  
ni en la calidad de KPIC  
en las diluciones  
examinadas.  
Se recuperaron todos  
los alelos STR; las  
pruebas de PSA y  
fosfatasa ácida  
Se detectó  
espermatozoides  
Detección  
microscópica hasta  
la dilución 1:1000  
después del  
tratamiento con  
ozono.  
diluciones con  
semen  
examinadas, pero  
sensibilidad,  
especificidad o  
exactitud no se  
estimó.  
Positivo:  
espermatozoide  
con morfología y  
patrón cromático  
característicos.  
perdieron capacidad de  
detección en diluciones  
altas.  
Hendin  
et al.  
(27)  
Fijación con  
Tinción de Wright y  
biopsia testicular.  
Control blanco de  
Cytospin y 10  
Se identificaron células  
germinales maduras en  
15/20 pacientes (75 %)  
y espermatozoides  
completamente  
formados en 9/20 (45  
%). Ninguno de los 10  
controles CBAVD fue  
positivo.  
Sensibilidad  
comunicada para  
detección de  
células germinales  
maduras: 75 %.  
Especificidad: 100  
% en 10 controles.  
Exactitud global:  
NR.  
Detección de  
espermatozoides y  
espermátidas raros  
o aislados en  
muestras  
inicialmente  
etanol durante 15  
min; Nuclear Fast  
Red durante 15  
min y  
picroindigocarmin  
e durante 15 s.  
Positivo:  
controles CBAVD.  
consideradas  
azoospérmicas.  
espermátidas  
redondas o  
espermatozoides  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
450  
Límite de  
detección y otros  
resultados  
Aplicación de  
KPIC y criterio de  
positividad  
Estándar de  
referencia y  
controles  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Autor(e  
s)  
Datos primarios de  
desempeño  
analíticos  
completos con  
cabeza roja y cola  
verde.  
Sharma  
et al.  
(28)  
Fijación con  
Examen en fresco y  
pellet conforme a  
OMS; mTESE como  
resultado clínico  
complementario.  
Control de calidad  
de donante sano y  
blanco de solución  
salina.  
NF-PIC detectó  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Detección de  
espermatozoides  
aislados  
concentrados en un  
área de 32 mm². No  
se informó  
etanol durante 15  
min; Nuclear Fast  
Red durante 15  
min y  
picroindigocarmin  
e durante 30 s.  
Lectura a 1000×.  
Positivo: cabeza  
roja o rosa y cola  
verde.  
espermatozoides en  
60/251 pacientes (23,9  
%) previamente  
clasificados como  
azoospérmicos.  
Entre 13 pacientes NF-  
PIC positivos sometidos  
a mTESE, se  
diagnóstica: NR.  
concentración  
mínima.  
recuperaron  
espermatozoides en 9  
(69,2 %).  
Leubitz  
&
Savage  
(14)  
Frotis secado al  
aire y tinción  
PIC/NF. Positivo:  
cabeza roja y cola  
verde a 400×. Se  
examinó 10  
campos y, si eran  
negativos, otros  
10 antes de emitir  
el resultado.  
Hemocitómetro de  
Neubauer y  
examen en fresco.  
Tres muestras  
azoospérmicas  
como controles  
negativos.  
Se observó  
Sensibilidad  
diagnóstica  
convencional: NR;  
detección en  
Umbral empírico  
aproximado: 0,12 ×  
10⁶  
espermatozoides/  
mL; a 0,09 ×  
10⁶/mL no se  
observaron  
espermatozoides a 0,10  
y 0,15 × 10⁶/mL. KPIC  
detectó  
espermatozoides en 5/6 muestras  
muestras  
oligospérmicas:  
oligospérmicas; las tres  
muestras  
5/6 (83,3 %).  
Especificidad  
observada: 3/3  
(100 %), con  
tamaño muestral  
limitado.  
Evaluación ciega de  
diluciones.  
espermatozoides  
en 20 campos.  
azoospérmicas fueron  
correctamente  
negativas.  
Humane  
s et al.  
(20)  
KPIC según  
Examen  
Modelo: precision 94 %,  
recall 72,3 % y mAP50 =  
0,842. En 30 casos, la  
lectura asistida detectó  
4,50 ± 1,60  
espermatozoides/mues  
tra frente a 3,14 ± 1,44  
manualmente (p <  
0,001; r = 0,78),  
Sensibilidad/recall: Detección de  
protocolo forense  
estandarizado;  
adquisición de  
imágenes a 20×.  
Detección con  
YOLOv10-L y  
confirmación por  
el perito.  
microscópico  
manual por tres  
peritos  
independientes.  
Parches con y sin  
espermatozoides  
para  
72,3 % a nivel de  
objeto.  
espermatozoides  
aislados en la  
lámina; no se  
estableció una  
concentración  
mínima.  
Especificidad: NR.  
Exactitud global:  
NR;  
desarrollo/evaluaci  
ón del algoritmo.  
Clasificación:  
ausente, raro (1–  
10) u ocasional  
(>10).  
incremento aproximado  
del 43 %.  
Mitchell  
(29)  
Secado al aire;  
Kernechtrot  
durante 15 min y  
picroindigocarmin  
e durante 15 s.  
Algoritmo basado  
en color,  
Microscopía  
manual de campo  
claro y contraste de más espermatozoides  
fase. Muestras  
negativas y  
muestras de  
donantes como  
controles.  
El sistema encontró  
106,28 % ± 115,37 %  
Sensibilidad  
Detección en  
diluciones de hasta  
1:100 000 y en  
muestras  
postcoitales de 90  
h o más.  
formal: NR; no se  
registraron falsos  
negativos en la  
que los analistas en los  
ensayos de sensibilidad. clasificación de  
En casos reales detectó  
214,10 % más que la  
lectura manual de  
láminas.  
Especificidad  
reportada: 100 %,  
sin denominador  
completo.  
contraste  
acrosómico y  
tamaño, seguido  
campo claro y 1770,68  
% más que el contraste  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
451  
Límite de  
detección y otros  
resultados  
Aplicación de  
KPIC y criterio de  
positividad  
Estándar de  
referencia y  
controles  
Sensibilidad,  
especificidad y  
exactitud  
Autor(e  
s)  
Datos primarios de  
desempeño  
analíticos  
de confirmación  
pericial.  
de fase. En 92,73 % de  
las láminas encontró un  
número igual o mayor  
que el analista.  
Exactitud global:  
NR.  
Alger et  
al. (30)  
Fijación por calor;  
Nuclear Fast Red  
durante 15 min y  
picroindigocarmin  
e durante menos  
de 10 s.  
Clasificación por  
tamaño, forma y  
color, seguida de  
revisión de la  
Comparación de  
plataformas  
automatizadas y  
tinciones de campo  
claro y  
fluorescentes.  
Láminas de control  
estándar para  
calibración.  
Se registraron tres  
falsos negativos en 376  
láminas, asociados con  
exceso de detritos o  
tinción deficiente;  
proporción global  
comunicada <1 %  
(aproximadamente 0,8  
%).  
Sensibilidad  
formal: NR,  
porque no se  
Capacidad de  
localizar un  
espermatozoide  
informó el número aislado en una  
total de láminas  
verdaderamente  
positivas.  
Especificidad y  
exactitud: NR.  
lámina completa.  
galería por el  
analista.  
Grosjea  
n &  
Castella  
(31)  
KPIC  
convencional,  
aproximadamente Hy-Liter;  
20 min;  
positividad  
basada en  
observación  
morfológica.  
Comparación  
directa con Sperm  
KPIC no fue afectada  
por la autofluorescencia especificidad y  
del sustrato, pero exactitud de KPIC:  
presentó dificultades en NR. La  
Sensibilidad,  
Se evaluaron  
diluciones hasta  
1:1000, pero no se  
determinó un límite  
de detección para  
KPIC.  
muestras puras,  
mezclas y blancos.  
agregados celulares  
densos.  
comparación fue  
predominantemen  
te cualitativa.  
Hy-Liter mostró  
desprendimiento  
celular, tinción  
heterogénea, efecto de  
anillo y variación  
asociada con DTT.  
Nota. KPIC: Kernechtrot-picroindigocarmín; H&E: hematoxilina-eosina; NR: no reportado; NE: no evaluado; NA: no  
aplicable; HPF: campo de gran aumento; CBAVD: ausencia bilateral congénita de los conductos diferentes; mTESE:  
extracción microquirúrgica de espermatozoides testiculares; CV: coeficiente de variación; mAP50: precisión media  
promedio con umbral de intersección sobre unión de 0,50.  
De acuerdo con los hallazgos, KPIC es una herramienta que logró detectar espermatozoides en  
muestras diluidas, envejecidas, contaminadas y previamente clasificadas como azoospérmicas,  
con incrementos de detección del 14,2 % y 23,9 % en dos estudios clínicos. El umbral cuantitativo  
más claramente definido fue de aproximadamente 0,12 × 10⁶ espermatozoides/mL, aunque  
otros trabajos informaron detección en diluciones de hasta 1:1000 o 1:100 000 y de células  
aisladas en una lámina completa.  
Se demostró que los sistemas automatizados no solo incrementaron el recuento, sino también  
la concordancia entre examinadores. El modelo más reciente alcanzó un recall del 72,3 %, una  
precision del 94 %, una mAP50 de 0,842 y un κ de Fleiss de 0,858. Sin embargo, solo unos pocos  
estudios proporcionaron denominadores y estándares de referencia suficientes para de manera  
formal estimar sensibilidad, especificidad y exactitud, lo que limita la comparación cuantitativa  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
452  
directa del desempeño de KPIC.  
La Tabla 5 resume la influencia de los factores preanalíticos y ambientales sobre los resultados  
de la tinción KPIC en los estudios incluidos. Se describen el tiempo transcurrido desde la  
deposición, recolección o preparación de las muestras; los procedimientos de toma,  
recuperación y concentración celular; las condiciones de almacenamiento y transporte; la  
composición y el sustrato; y las exposiciones ambientales o procesos de degradación evaluados.  
Tabla 5. Influencia de los factores preanalíticos y ambientales en los resultados de la tinción KPIC  
Tiempo desde  
la deposición,  
recolección o  
preparación  
Toma,  
Almacenamie  
nto y  
transporte  
Composición  
de la muestra y  
sustrato  
Exposición  
ambiental o  
degradación  
Autor(e  
s)  
recuperación y  
preparación de  
la muestra  
Efecto observado  
sobre KPIC  
Athira  
et al.  
(23)  
Evaluación a  
las 24 h, 1  
semana, 2  
semanas y 1  
mes después  
de la  
Extracción de la  
mancha en agua  
acidulada  
durante 2 h;  
centrifugación a  
3000 rpm  
Semen  
original  
conservado a  
4 °C. Manchas  
dobladas y  
Semen de un  
donante  
depositado en  
algodón  
Exposición  
química y  
biológica, junto  
con  
envejecimiento  
durante 30  
días.  
La contaminación no  
impidió la detección,  
aunque la densidad  
espermática  
disminuyó con el  
tiempo. Se  
blanco, con  
almacenadas a detergentes,  
deposición.  
durante 20 min  
y preparación  
del frotis con el  
pellet celular.  
temperatura  
ambiente  
simulada  
durante un  
mes.  
lubricantes de  
preservativos,  
tierra o saliva.  
observaron células  
hasta los 30 días;  
DAPI mostró mayor  
constancia ante  
contaminación  
intensa.  
Montei  
ro et al.  
(24)  
Procesamient  
o después de  
la licuefacción  
de muestras  
obtenidas tras  
48–72 h de  
Recolección por  
masturbación;  
centrifugación  
inicial a 3000g  
durante 15 min,  
evaluación del  
pellet y, si era  
negativo,  
Procesamient  
o inmediato  
en un  
laboratorio  
andrológico;  
transporte no  
descrito.  
Sedimento de  
semen de  
pacientes  
inicialmente  
clasificados  
como  
azoospérmicos,  
extendido  
sobre  
No se evaluó  
exposición  
ambiental; las  
muestras  
procedían de  
pacientes con  
alteraciones  
espermatogéni  
cas.  
La concentración del  
sedimento permitió  
detectar  
espermatozoides en  
21/148 muestras  
(14,2 %)  
abstinencia.  
previamente  
negativas.  
microcentrifugac  
ión a 2000g  
portaobjetos.  
durante 15 min  
antes de  
extender el  
sedimento  
completo.  
Allery  
et al.  
(15)  
Intervalos  
Hisopado  
Condiciones y  
duración del  
almacenamien s sobre  
to no  
reportadas.  
Muestras  
cervicovaginale  
Degradación en  
la cavidad  
vaginal  
asociada con el  
tiempo  
La detección  
disminuyó con el  
tiempo. KPIC  
identificó 9,1  
espermatozoides/ca  
mpo frente a 2,6 con  
postcoitales  
<12 h, 12–72  
h y >72 h.  
cervicovaginal  
realizado con  
espéculo;  
preparación  
directa de tres  
portaobjetos  
de vidrio.  
postcoital y la  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
453  
Tiempo desde  
la deposición,  
recolección o  
preparación  
Toma,  
Almacenamie  
nto y  
transporte  
Composición  
de la muestra y  
sustrato  
Exposición  
ambiental o  
degradación  
Autor(e  
s)  
recuperación y  
preparación de  
la muestra  
Efecto observado  
sobre KPIC  
frotis paralelos  
por muestra.  
carga  
H&E entre 12–72 h;  
ninguna tinción  
detectó células  
espermática  
inicial. No se  
realizaron  
duchas  
después de 72 h.  
vaginales.  
Panicke  
r et al.  
(25)  
Envejecimient  
o durante 1, 3, cm del centro de controlada a  
5 y 7 días.  
Corte de 1 × 1  
Incubación  
Semen  
Secado y  
La densidad  
espermática  
disminuyó con la  
antigüedad de la  
mancha (r = −0,77 a  
−0,94). KPIC  
depositado en  
algodón, nailon  
y mezclilla.  
envejecimiento  
; absorción de  
la muestra en  
fibras  
naturales,  
sintéticas y  
teñidas.  
la tela;  
25 °C durante  
un máximo de  
7 días.  
inmersión en  
500 µL de agua  
destilada,  
agitación  
mantuvo resultados  
positivos hasta los 7  
días, con mayor  
recuperación en  
algodón.  
durante 2 min,  
reposo nocturno  
y preparación  
del frotis con 5  
µL del extracto.  
Simons  
&
Vintiner después de 0,  
Láminas  
evaluadas  
Frotis directo de  
células  
vaginales;  
fijación en  
acetona y, para  
Láminas  
montadas con  
DPX y  
almacenadas a portaobjetos  
temperatura  
ambiente  
durante un  
máximo de 10  
semanas.  
Células  
epiteliales  
vaginales sobre  
Almacenamient KPIC y H&E  
o prolongado y  
exposición a  
reactivos de  
tinción.  
presentaron mayor  
recuperación de  
ADN, sin interacción  
significativa entre  
tinción y  
(26)  
2, 4 y 10  
semanas de  
almacenamien la recuperación  
to.  
convencionales  
o recubiertos  
con poli-L-  
lisina.  
de ADN, retirada  
del  
cubreobjetos,  
raspado y  
almacenamiento (p  
= 0,42). Se  
obtuvieron perfiles  
STR informativos  
tras 10 semanas; no  
se evaluó el efecto  
sobre la detección  
espermática.  
extracción con  
proteinasa K y  
fenol-  
cloroformo.  
Fejes et  
al. (11)  
Secado de las  
muestras  
durante al  
menos 3 h  
antes del  
Se depositaron  
10 µL de  
muestra sobre  
portaobjetos; las posterior  
preparaciones se tratamiento  
asignaron a un  
grupo tratado  
Secado a  
temperatura  
ambiente y  
Semen puro y  
diluido hasta  
1:1000, junto  
con sangre y  
saliva, sobre  
Exposición a  
ozono, un  
agente  
oxidante  
utilizado para  
desinfección.  
El ozono no alteró  
visiblemente la  
morfología ni la  
tinción KPIC. Se  
detectaron  
espermatozoides  
hasta una dilución  
1:1000 y se  
tratamiento.  
en una cámara portaobjetos y  
de ozono; algodón.  
con ozono y a un transporte no  
grupo control. aplicable.  
recuperaron todos  
los alelos STR.  
Hendin  
Procesamient  
Después de tres  
Procesamient  
Semen de  
No hubo  
La concentración  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
454  
Tiempo desde  
la deposición,  
recolección o  
preparación  
Toma,  
Almacenamie  
nto y  
transporte  
Composición  
de la muestra y  
sustrato  
Exposición  
ambiental o  
degradación  
Autor(e  
s)  
recuperación y  
preparación de  
la muestra  
Efecto observado  
sobre KPIC  
et al.  
(27)  
o inmediato  
durante la  
evaluación  
clínica; no se  
informó un  
intervalo  
frotis húmedos  
negativos, se  
prepararon dos  
frotis largos, dos  
láminas Cytospin  
a 310g durante  
10 min y una  
lámina en  
o rutinario  
inmediato a  
temperatura  
ambiente.  
pacientes con  
falla  
espermatogéni  
ca,  
concentrado  
mediante  
Cytospin sobre  
portaobjetos.  
exposición  
ambiental; la  
escasez celular  
se relacionó  
con  
alteraciones  
graves de la  
espermatogéne  
sis.  
celular permitió  
identificar células  
germinales maduras  
en 15/20 pacientes  
(75 %) y  
espermatozoides  
completos en 9/20  
(45 %).  
específico  
desde la  
eyaculación.  
blanco.  
Sharma  
et al.  
(28)  
Análisis  
Examen en  
Procesamient  
o inmediato a  
temperatura  
ambiente;  
transporte no  
descrito.  
Pellet de  
semen de  
pacientes con  
azoospermia o  
criptozoosperm dificultad  
ia, concentrado  
sobre  
portaobjetos.  
No se  
La concentración  
mediante Cytospin  
con NF-PIC permitió  
detectar  
espermatozoides en  
60/251 pacientes  
(23,9 %)  
previamente  
clasificados como  
azoospérmicos.  
después de la  
licuefacción  
completa y  
procesamient  
o inmediato.  
fresco con 6 µL;  
centrifugación  
OMS a 3000g  
durante 15 min;  
reevaluación del  
pellet y, si era  
negativo,  
concentración  
mediante  
Cytospin a 500g  
durante 10 min  
en un área de 32  
mm².  
evaluaron  
condiciones  
ambientales; la  
analítica fue la  
baja  
concentración  
espermática  
asociada con  
falla  
espermatogéni  
ca.  
Leubitz  
&
Savage  
(14)  
Muestras  
frescas  
procesadas  
dentro de las  
4 h  
posteriores a  
la eyaculación. frotis mediante  
gota directa o  
Recuento en  
hemocitómetro,  
dilución seriada  
con solución  
salina y  
Procesamient  
o inmediato;  
no se evaluó  
almacenamien  
to  
Semen fresco,  
muestras  
oligospérmicas  
y
azoospérmicas,  
y diluciones  
sobre  
Dilución  
extrema para  
simular la  
dispersión del  
semen en  
secreciones o  
lavados.  
La detección  
disminuyó con la  
concentración  
espermática. KPIC  
identificó células a  
≈0,12 × 10⁶/mL, pero  
no a 0,09 × 10⁶/mL  
tras examinar 20  
campos; detectó 5/6  
muestras  
preparación de  
prolongado.  
portaobjetos.  
hisopo de  
algodón.  
oligospérmicas.  
Human  
es et al.  
(20)  
Muestras  
procedentes  
de casos  
Extracción con  
Tris-EDTA, SDS y  
proteinasa K;  
incubación a 42  
°C durante 30  
min,  
Conservación  
conforme al  
protocolo del  
laboratorio  
forense;  
Extractos de  
hisopos y  
prendas de  
casos de  
Degradación y  
composición  
heterogénea  
propias de  
casos reales  
archivados.  
En muestras de  
casos reales, la  
lectura asistida  
identificó  
aproximadamente  
un 43 % más de  
espermatozoides  
que la manual; no se  
cuantificó el efecto  
forenses  
cerrados y  
archivados;  
antigüedad no  
especificada.  
agresión  
duración y  
sexual, con  
carga variable  
de células  
epiteliales,  
centrifugación a  
10 000 rpm  
transporte no  
reportados.  
durante 5 min,  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
455  
Tiempo desde  
la deposición,  
recolección o  
preparación  
Toma,  
Almacenamie  
nto y  
transporte  
Composición  
de la muestra y  
sustrato  
Exposición  
ambiental o  
degradación  
Autor(e  
s)  
recuperación y  
preparación de  
la muestra  
Efecto observado  
sobre KPIC  
resuspensión del  
pellet, depósito  
en lámina y  
moco y  
detritos.  
individual de las  
condiciones de  
conservación y  
degradación.  
secado al aire.  
Mitchel  
l (29)  
Muestras  
postcoitales  
obtenidas  
entre 0 y más  
de 90 h  
Recuperación  
del material del  
hisopo con una  
pequeña  
cantidad de  
agua  
desionizada y  
preparación del  
frotis; secado al  
aire durante 1 h.  
Secado y  
procesamient  
o,  
temperatura  
ambiente.  
Semen puro o  
diluido; hisopos la cavidad  
vaginales,  
orales, rectales  
y postcoitales;  
muestras con  
lubricantes,  
jabones o  
Degradación en  
El sistema detectó  
espermatozoides  
hasta una dilución  
1:100 000 y en  
vaginal,  
dilución y  
presencia de  
contaminantes  
biológicos o  
químicos.  
muestras  
después del  
coito.  
postcoitales de ≥90  
h. Igualó o superó la  
lectura manual en el  
92,73 % de las  
levaduras.  
láminas, sin falsos  
negativos entre las  
positivas.  
Alger et Láminas de  
al. (30)  
Incubación de  
casos activos y recortes o  
Conservación  
conforme a  
los  
Extractos de  
hisopos y  
recortes de tela durante el  
Degradación de  
la tinción  
Se registraron 3  
falsos negativos en  
376 láminas (0,8 %),  
asociados con  
detritos o tinción  
deficiente. El  
almacenamiento  
prolongado redujo la  
intensidad cromática  
y ocasionalmente  
exigió reteñido.  
archivados;  
duración del  
archivo no  
hisopos en  
aproximadamen  
te 200 µL de HBS s del  
durante 30 min  
a 4 °C,  
procedimiento con mezclas  
archivo y  
fondos  
complejos con  
detritos.  
celulares y  
abundantes  
detritos.  
especificada.  
laboratorio  
forense.  
centrifugación y  
transferencia del  
pellet a la  
lámina; secado y  
fijación por  
calor.  
Grosjea  
n &  
Castella  
(31)  
Muestras  
Recuperación de  
células de  
FLOQSwabs en  
Universal Buffer  
o PBS;  
preparación  
sobre láminas y  
aplicación de  
KPIC o Sperm  
Hy-Liter.  
Procesamient  
o según  
protocolo del  
laboratorio;  
duración y  
Semen diluido  
entre 1:20 y  
1:1000,  
Mezclas  
celulares  
densas,  
microorganism  
os y  
autofluorescen  
La autofluorescencia  
del sustrato no  
afectó a KPIC, pero  
los agregados  
celulares densos  
dificultaron la  
simuladas y  
casos reales;  
tiempo desde  
la deposición  
no  
mezclas  
biológicas,  
bacterias,  
levaduras y  
muestras sobre  
sustratos  
transporte no  
reportados.  
especificado.  
cia del sustrato. identificación. Se  
evaluaron diluciones  
hasta 1:1000, sin  
determinar un límite  
autofluorescen  
tes.  
formal de detección.  
Nota. KPIC: Kernechtrot-picroindigocarmine; H&E: hematoxilina-eosina; DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol; OMS:  
Organización Mundial de la Salud; HBS: solución salina tamponada con HEPES; NR: no reportado; NE: no evaluado.  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
456  
Los resultados mostraron que el tiempo, la concentración celular, el sustrato y la complejidad  
de la muestra modificaron la capacidad de detección con KPIC. La microcentrifugación y  
Cytospin incrementaron la detección en un 14,2 % y 23,9 %, respectivamente, en muestras  
previamente clasificadas como azoospérmicas. La antigüedad redujo la densidad espermática  
de manera progresiva: no se detectaron espermatozoides después de 72 h en muestras  
cervicovaginales, aunque en tejidos sí se mantuvieron hasta 7 días. A las células que estaban en  
la materia residual se les pudo ubicar dispersas a los 30 días en el algodón contaminado. Estas  
diferencias corresponden a matrices y protocolos distintos y no representan límites temporales  
directamente comparables.  
El algodón mostró una recuperación mucho más alta que la de nailon y la mezclilla, mientras  
que la exposición a ozono no alteró la morfología ni el patrón de tinción hasta una dilución de  
1:1000. En muestras forenses complejas, los detritos, los agregados celulares densos, la mala  
tinción y la pérdida de intensidad durante el almacenamiento por largo tiempo, dificultaron la  
identificación, en tanto que la autofluorescencia del sustrato no afectó la lectura de KPIC.  
KPIC mostró un rendimiento global similar al de H&E, pero fue más fácil de leer y permitió  
observar un número de espermatozoides más alto por campo. Aparte de esto, mostró una mejor  
confirmación morfológica que las pruebas presuntivas y tuvo menos interferencia por  
autofluorescencia que los métodos fluorescentes. En comparación, Sperm Hy-Liter estuvo  
disponible con un tiempo de preparación menor y un costo estimado entre 40 y 50 veces  
inferior, aunque su rendimiento fue limitado en el reconocimiento de espermatozoides en  
agregados celulares densos. DAPI fue más veloz y mantuvo una tasa de detección más constante  
en algunas muestras muy contaminadas, mientras que KPIC requirió mayor tiempo y una  
búsqueda microscópica dependiente del observador.  
La Tabla 6 presenta las ventajas y desventajas de la tinción KPIC frente a las principales técnicas  
empleadas para la identificación y el análisis de espermatozoides.  
Tabla 6. Ventajas y desventajas de KPIC frente a otras técnicas de identificación y análisis de espermatozoides.  
Principales  
hallazgos  
comparativos  
Técnica  
comparadora  
Clase de  
técnica  
Ventajas de  
KPIC  
Desventajas  
de KPIC  
Aspectos  
operativos  
Autor(es)  
Hematoxilina-  
eosina (H&E) y  
fucsina alcalina  
Microscópic  
a/ citológica  
Detección similar  
a H&E (35,1 %  
frente a 34,7 %),  
pero mayor  
Mayor  
No evita la  
pérdida de  
espermatozoid convencional;  
Microscopio  
óptico  
(11,15,26)  
contraste y  
diferenciación  
morfológica;  
compatible con muestras  
perfiles STR. cervicovaginal  
es en  
preparación  
aproximada de  
15–20 min,  
número de  
espermatozoides  
por campo (8,3  
frente a 4,6 y 4,2,  
respectivamente;  
p = 0,023 y p =  
es después de  
72 h; requiere  
manipulación  
segura del  
además de  
fijación y  
montaje. Las  
láminas pueden  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
457  
Principales  
hallazgos  
Técnica  
comparadora  
Clase de  
técnica  
Ventajas de  
KPIC  
Desventajas  
de KPIC  
Aspectos  
operativos  
Autor(es)  
comparativos  
0,017).  
ácido pícrico.  
conservarse  
para revisión  
posterior.  
Recuperación de  
ADN comparable  
a H&E.  
Tinción de Wright Microscópic  
a/ citológica  
KPIC identifica  
células germinales de  
maduras, pero  
Wright permite  
diferenciar  
estructuras  
redondas  
morfológicament  
e ambiguas.  
Identificación  
Posible  
confusión  
entre  
espermátidas  
redondas y  
leucocitos;  
requiere  
tinción  
Requiere  
preparación de  
láminas  
adicionales y  
lectura  
microscópica  
complementari  
a, lo que  
(27)  
espermatozoid  
es completos y  
células  
germinales  
escasas.  
complementar incrementa el  
ia.  
tiempo y el  
consumo de  
muestra.  
Examen en  
fresco,  
Microscópic  
a
Tras la  
Mayor  
contraste,  
Rendimiento  
dependiente  
de  
concentración  
previa,  
extensión de  
la búsqueda y  
experiencia  
del  
observador;  
posible  
Microscopio  
óptico de 400–  
1000× y, según  
el protocolo,  
microcentrífuga  
o Cytospin. En  
muestras muy  
diluidas se  
requieren al  
menos 20  
campos de gran  
aumento o una  
búsqueda  
(14,24,28,2  
9)  
concentración,  
KPIC detectó  
espermatozoides  
en el 14,2 % y  
23,9 % de  
microscopía de  
contraste de fase  
y procedimientos  
convencionales  
de la OMS  
detección de  
células escasas  
y conservación  
de  
preparaciones  
permanentes.  
muestras  
previamente  
clasificadas como  
azoospérmicas.  
Detección  
aproximada de  
0,12 × 10⁶  
consumo del  
sedimento.  
espermatozoides/  
mL en diluciones  
seriadas.  
extendida.  
Pruebas de  
Florence,  
Barberio,  
luminiscencia UV  
y evaluación  
mediante VSC  
Presuntiva/  
microquímic presuntivas  
permiten localizar  
Las pruebas  
Mayor  
Mayor tiempo  
de  
procesamiento son rápidas,  
(15–25 min de  
tinción, más  
lectura);  
rendimiento  
condicionado  
por la  
Las pruebas  
preliminares  
(23,25)  
especificidad  
morfológica  
frente a  
señales  
presuntivas  
inespecíficas.  
a
manchas, pero  
pueden presentar  
interferencias.  
KPIC aporta  
confirmación  
morfológica  
mediante  
mientras que  
KPIC requiere  
aproximadame  
nte 15–25 min  
de tinción más  
la lectura. El  
VSC necesita  
instrumentació  
n específica.  
degradación  
celular.  
visualización  
directa de  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
458  
Principales  
hallazgos  
Técnica  
comparadora  
Clase de  
técnica  
Ventajas de  
KPIC  
Desventajas  
de KPIC  
Aspectos  
operativos  
Autor(es)  
comparativos  
espermatozoides.  
Fosfatasa ácida y  
PSA  
Presuntiva e  
inmunológic  
a
Tras exposición a  
ozono, KPIC  
permitió  
identificar  
espermatozoides  
Identificación  
morfológica  
pese al  
tratamiento  
oxidativo y  
Requiere  
células  
Microscopio  
óptico y  
protocolo de  
tinción  
convencional.  
Las pruebas  
inmunológicas  
o enzimáticas  
son más  
sencillas para el  
cribado, pero  
no  
(11)  
reconocibles;  
no se dispone  
de  
estimaciones  
comparativas  
formales de  
sensibilidad y  
especificidad.  
hasta una dilución menor  
1:1000, mientras  
que las pruebas  
basadas en  
marcadores  
seminales  
dependencia  
de marcadores  
solubles.  
perdieron  
capacidad de  
detección en  
diluciones altas.  
proporcionan  
confirmación  
morfológica.  
DAPI, SYBR Green  
y naranja de  
acridina  
Fluorescent  
e
DAPI presentó  
mayor rapidez y  
detección más  
constante en  
algunas muestras  
contaminadas.  
Los métodos  
fluorescentes  
mostraron  
Microscopía  
convencional,  
menor costo  
de reactivos y  
ausencia de  
interferencia  
por  
Procesamiento KPIC utiliza un  
(23,30,31)  
más lento;  
menor  
microscopio  
óptico  
rendimiento  
visual con  
abundantes  
detritos o  
degradación  
severa.  
convencional.  
Las técnicas  
fluorescentes  
requieren  
microscopio o  
sistema  
autofluorescen  
cia del  
interferencias de  
fondo o tinción  
inespecífica,  
mientras que KPIC  
conservó el  
sustrato.  
espectral,  
filtros, reactivos  
específicos y  
control de  
fondo; DAPI  
implica además  
consideraciones  
de toxicidad.  
detalle  
morfológico.  
Sperm Hy-Liter  
Inmunológic  
a/  
fluorescente agregados  
celulares,  
Hy-Liter presentó  
fluorescencia en  
Menor costo y  
complejidad  
operativa;  
identificación  
morfológica en  
campo claro.  
Menor  
capacidad  
para localizar  
espermatozoid min de  
es en  
KPIC:  
aproximadame  
nte 0,5 € y 20  
(30,31)  
desprendimiento  
celular y  
preparación por  
muestra. Hy-  
agregados  
variabilidad de  
tinción. KPIC evitó  
interferencias por  
autofluorescencia  
, con menor  
densos; carece Liter:  
de selectividad aproximadame  
inmunológica.  
nte 20–25 €, 60  
min de  
preparación y  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
459  
Principales  
hallazgos  
Técnica  
comparadora  
Clase de  
técnica  
Ventajas de  
KPIC  
Desventajas  
de KPIC  
Aspectos  
operativos  
Autor(es)  
comparativos  
tiempo y costo de  
preparación (0,5 €  
y 20 min frente a  
20–25 € y 60  
microscopio de  
fluorescencia.  
El costo  
estimado de  
Hy-Liter fue 40–  
50 veces  
min).  
mayor.  
Inmunohistoquím Inmunológic  
KPIC permitió  
recuperar más  
ADN por célula y  
no presentó  
inhibición de PCR,  
a diferencia de  
DAB y Danes.  
Conservó ADN  
utilizable al  
Mejor  
Recuperación  
celular  
mediante  
desmontaje y  
raspado;  
precauciones  
por el uso de  
ácido pícrico.  
Para el  
(26)  
ica DAB y tinción  
de Danes  
a/  
compatibilidad  
con extracción  
de ADN, PCR y  
perfiles STR;  
permite  
procesamiento  
posterior se  
requieren  
procedimientos  
de extracción,  
PCR y  
electroforesis  
capilar. KPIC  
conserva  
histoquímic  
a
modificada  
reexaminar  
preparaciones.  
menos 10  
semanas en las  
condiciones  
material  
genético  
estudiadas.  
utilizable hasta  
por lo menos  
10 semanas en  
las condiciones  
evaluadas.  
Nota. KPIC: Kernechtrot-picroindigocarmine; H&E: hematoxilina-eosina; DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol; PSA:  
antígeno prostático específico; VSC: comparador espectral de video; DAB: 3,3′-diaminobencidina; RT-qPCR:  
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa; STR: repeticiones cortas en tándem;  
DTT: ditiotreitol;  
DISCUSIÓN  
Los resultados han demostrado que la tinción KPIC sigue siendo una metodología importante  
para la identificación de espermatozoides en muestras forenses y en muestras experimentales.  
Su principal fortaleza es el contraste diferencial entre la cabeza roja o rosada y la cola verde,  
que facilita reconocer células escasas, fragmentadas o inmersas en fondos con células  
epiteliales. La detección de espermatozoides aislados en muestras inicialmente clasificadas  
como azoospérmicas, diluciones elevadas y manchas envejecidas respalda su sensibilidad  
práctica (14,24,27,28).  
La evidencia cuantitativa no es uniforme. Leubitz y Savage (14) situaron el límite de detección  
alrededor de 0,10–0,15 × 10⁶ espermatozoides/mL, mientras que Monteiro et al. (24) y Sharma  
et al. (28) reclasificaron como criptozoospérmicas el 14,2 % y el 23,9 % de muestras consideradas  
azoospérmicas mediante procedimientos convencionales. Allery et al. (15) encontraron una tasa  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
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global similar entre KPIC y hematoxilina-eosina, aunque KPIC permitió visualizar más  
espermatozoides por campo. Estos resultados no corresponden a una sensibilidad clínica o  
forense generalizable, pues son de diferentes poblaciones, preparaciones y referencias.  
Asimismo, la ausencia de espermatozoides después de 72 horas en muestras cervicovaginales  
(15) debe interpretarse considerando los procesos de degradación y eliminación propios del  
medio intravaginal. La actividad ezimática y la respuesta inmunitaria, incluida la fagocitosis de  
espermatozoides por leucocitos, constituyen mecanismos que pueden contribuir a la reducción  
progresiva de las células disponibles para su identificación microscópica (32,33). Por el  
contrario, la detección de hasta 7 días en telas y hasta 30 días en manchas contaminadas (23,25),  
corresponde a la persistencia de estructuras espermáticas en soportes externos, donde no  
actúan los mecanismos de eliminación del tracto genital y la desecación puede favorecer su  
conservación durante semanas.  
Por tanto, los resultados son compatibles y reflejan la influencia de la matriz y de las condiciones  
de conservación sobre la detectabilidad espermática. El intervalo de 72 horas observado no  
debe extrapolarse a manchas secas ni interpretarse como un límite universal para muestras  
intravaginales. Por consiguiente, el rendimiento de la tinción Christmas Tree debe evaluarse  
teniendo en cuenta el lugar de recogida, el tiempo transcurrido y la eficiencia en la recuperación  
celular. El algodón permitió una mejor recuperación que la tela vaquera, mientras que la  
presencia de tierra, hongos, lubricantes y residuos dificultó la interpretación. En cambio, el  
ozono no alteró la morfología ni la capacidad de detección hasta una dilución de 1:1000. (11).  
Los hallazgos coinciden con revisiones que mantienen la microscopía como referencia para  
demostrar espermatozoides, pero advierten su dependencia del observador y su incapacidad  
ante azoospermia o ausencia celular (34,35). Las innovaciones recientes buscan resolver esos  
límites sin demostrar todavía una sustitución universal de KPIC. Una red convolucional aplicada  
a imágenes microscópicas alcanzó una exactitud del 95%(36), en consonancia con el aumento  
de detección y concordancia interobservador observado mediante KPICS, MetaSystems y Spitz  
(20,29,30).  
No obstante, los candidatos falsos positivos y los fallos en frotis densos o mal teñidos mantienen  
necesaria la verificación humana. En paralelo, un sistema microfluídico con análisis de imágenes  
procesó muestras simuladas en menos de 15 minutos y superó el 95 % de exactitud frente al  
recuento manual (37), mientras que un ensayo 3-plex MSRE-PCR produjo resultados  
concordantes en seis laboratorios (38). La nueva tinción fluorescente CPM/AO también mostró  
capacidad para detectar espermatozoides en muestras envejecidas (39), pero requiere  
validación comparativa en casuística real.  
En la práctica, KPIC resulta adecuado para laboratorios con recursos limitados por su bajo costo,  
disponibilidad y compatibilidad con microscopía de campo claro. La comparación económica  
disponible estima un costo de reactivos por muestra de aproximadamente 40 o 50 veces menor  
que Sperm Hy-Liter. Esto, sumado a un procedimiento más sencillo y a la ausencia de  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
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461  
interferencia por autoflorescencia, favorece su implementación cuando el presupuesto y el  
equipamiento son limitados. Las técnicas fluorescentes o DAPI pueden facilitar el trabajo incluso  
en muestras contaminadas (23,31).  
Por otra parte, Simons y Vintiner (26) lograron recuperar los perfiles STR informativos de las  
muestras KPIC que fueron almacenadas, aun cuando usaron células epiteliales vaginales como  
modelo. Su implementación debe incorporar controles positivos, negativos y de contaminación;  
criterios mínimos para la toma de muestras mediante frotis y para determinar la positividad;  
capacitación y pruebas de competencia; documentación fotográfica; y protocolos diferenciados  
según el sustrato, la antigüedad y la carga de residuos. Un resultado negativo debe interpretarse  
junto con las pruebas de fosfatasa ácida, PSA/P30 o semenogelina, los antecedentes de la  
muestra y los resultados genéticos.  
El número limitado de investigaciones, la heterogeneidad que presentan en su diseño, así como  
la combinación de muestras clínicas, simuladas y forenses, constituyen las limitaciones de esta  
revisión. Se observó principalmente tamaños pequeños, investigaciones de un solo centro o  
donante y resultados cualitativos. Además, rara vez se calculan la sensibilidad, la especificidad,  
la exactitud y la reproducibilidad frente a un estándar independiente. Las discrepancias en  
cuanto a la extracción, la fijación, la formulación, el aumento microscópico y la definición de  
positividad impidieron realizar un metaanálisis. La inclusión de estudios técnicos y antiguos  
amplió la cobertura operativa, pero a la vez aumentó la variabilidad metodológica y el riesgo de  
sesgo de publicación.  
Los futuros estudios deben llevar a cabo verificaciones prospectivas, multicéntricas y ciegas,  
utilizando muestras reales y simuladas estandarizadas, incluir condiciones ambientales y  
sustratos locales, y reportar matrices completas de exactitud, límites de detección e  
incertidumbre inter-observador. Asimismo, se debe evaluar el consumo de muestra, la  
recuperación posterior de ADN, el costo por caso y el tiempo activo de procesamiento. Aunque  
la  
automatización  
es  
prometedora,  
requiere  
principalmente  
conjuntos  
externos  
representativos, criterios auditables y supervisión pericial.  
CONCLUSIONES  
La evidencia disponible corrobora la utilidad analítica de KPIC para confirmar  
microscópicamente la presencia de espermatozoides, aun cuando estos son escasos, se  
encuentran diluidos o presentan pérdida parcial de su estructura. El contraste diferencial de sus  
componentes facilita la identificación morfológica frente a células epiteliales y detritos. pesar  
de eso, el diseño heterogéneo y la falta de datos sobre sensibilidad, especificidad y exactitud,  
impiden la posibilidad de definir una técnica universal para el diagnóstico. Así, Christmas Tree  
constituye una técnica muy certera para identificar células espermáticas cuando están  
presentes.  
El rendimiento de la técnica KPIC se ve influido considerablemente por variables preanalíticas.  
IMPORTANCIA DE LA TINCIÓN CHRISTMAS TREE EN LA IDENTIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: UNA REVISIÓN  
SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA  
462  
El paso del tiempo reduce progresivamente el número de espermatozoides recuperables y  
favorece la fragmentación celular, si bien la velocidad de degradación difiere entre las muestras  
cervicovaginales y las manchas secas. Además, el tipo de sustrato, la eficiencia del  
procedimiento de recuperación y la presencia de suciedad, microorganismos, lubricantes o  
detritos pueden reducir la visibilidad y dificultar la interpretación. Los datos relativos al  
almacenamiento y transporte carecían de una base científica suficiente para establecer límites  
generales de tiempo o condiciones ambientales.  
En comparación con otras técnicas, KPIC ofrece un equilibrio favorable entre capacidad de  
confirmación morfológica, coste, disponibilidad equipo requerido, además de ser compatible  
con análisis genéticos posteriores. La tinción con hematoxilina-eosina tuvo un rendimiento  
global que fue similar, aunque de manera general se observó un menor contraste. Las técnicas  
fluorescentes, moleculares y automatizadas no solo pueden aumentar la detección de las células  
escasas, sino que también, en consecuencia, reducir la búsqueda manual, o, incluso, garantizar  
la identificación de direcciones seminales en la ausencia de espermatozoides. Sin embargo, su  
aplicación va acompañada de una mayor inversión, a la vez de la necesidad de una  
infraestructura especializada, y aun así requieren verificación humana o una validación adicional  
sobre muestras reales.  
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